全自動(dòng)生化儀之基本參數及應用

　　了解生化分析儀基本參數的原理，有利于儀器、試劑的正確使用，有助于正確分析和處理測定數據。但是，配套系統的原裝分析參數不宜更改；采用非儀器配套的試劑及校準品體系時(shí)，參數修改要慎重，對于不同儀器、不同類(lèi)型的反應分析程序，所顯示的人機對話(huà)分析參數信息有所不同。
 

　　一、反應監測時(shí)間
 

　　對于終點(diǎn)法來(lái)說(shuō)，讀取反應達到平衡時(shí)的吸光度計算樣品中待測物的濃度。對于連續監測法來(lái)說(shuō)，要注意觀(guān)察反應進(jìn)程曲線(xiàn)，從而確定反應的預孵育期，延遲時(shí)間、連續監測的時(shí)段。對于一級或偽一級反應來(lái)說(shuō)，連續監測的時(shí)間是一級反應的動(dòng)態(tài)期的吸光度；對于基于零級反應的酶催化活性濃度速率法測定，連續監測的是零級線(xiàn)性反應期的吸光度。對于連續監測法來(lái)說(shuō)，動(dòng)態(tài)反應期的時(shí)間越長(cháng)，越適用于臨床應用，對于以酶為工具的代謝物酶促動(dòng)力測定法，要增加動(dòng)態(tài)反應期，即延長(cháng)反應達到平衡的時(shí)間，可在反應體系中加入競爭性抑制劑，這樣還可以提高測定的線(xiàn)性范圍，對于酶催化活性濃度連續監測法來(lái)說(shuō)，一定要注意線(xiàn)性反應時(shí)間，有的酶，例如，以硫代丁酰膽堿為底物的血清假性膽堿酯酶速率測定法，線(xiàn)性反應時(shí)間只有90秒。對于連續監測法來(lái)說(shuō)，在監測期至少應讀4個(gè)點(diǎn)(3個(gè)△A)。
 

　　多數全自動(dòng)生化分析儀可以在整個(gè)測定反應周期連續監測(如HITACHI7170常規測定周期10分鐘、監測34點(diǎn)，OLYMPUSAU600固定周期8分15秒、監測27點(diǎn))，但反應監測時(shí)間是指該時(shí)間內的測定讀數要用于結果計算。它的設置與加樣點(diǎn)、加試劑點(diǎn)(包括R1、R2……)、監測時(shí)間(讀數點(diǎn))、讀數間隔時(shí)間及試劑樣品比例等有關(guān)，要結合方法學(xué)，兼顧權衡。
 

　　1.反應時(shí)間(ReactionTime)指儀器的一個(gè)分析周期中，試劑和樣品混合末一點(diǎn)測定讀數時(shí)間。它對終點(diǎn)法尤其重要，是終點(diǎn)法的瓶頸。有的儀器多個(gè)反應時(shí)間可選L如Hl—TACHI7170)，須預先選定。多數儀器10分鐘左右，這對試劑提出了較高要求。不少終點(diǎn)法試劑(尤其手工法試劑)反應時(shí)間常常也在lO分鐘上下，測定時(shí)間沒(méi)有余地，當樣品濃度高或試劑質(zhì)量下降時(shí)，均可致測定結果偏低。因此，終點(diǎn)法不宜采用標明反應時(shí)間接近和長(cháng)于儀器大反應時(shí)間的試劑盒。否則，必須用接近測定范圍上限的高濃度質(zhì)控血清監測。
 

　　2.監測時(shí)間(讀數點(diǎn))和讀數間隔時(shí)間各類(lèi)型儀器不盡一致。離心式生化儀讀數間隔時(shí)間短，監測時(shí)間也短。流動(dòng)式生化儀讀數間隔時(shí)間一般較長(cháng)。分立式生化儀一般監測時(shí)間10分鐘左右，間隔10-30秒讀數一次。有的儀器在整個(gè)測定反應周期全程讀數，有的只讀取時(shí)間(點(diǎn))的吸光度。
 

　　3.加試劑點(diǎn)采用雙試劑時(shí)，加R2點(diǎn)決定R1與樣品的反應時(shí)間，也決定R2與R1及樣品的反應時(shí)間。一般儀器各5分鐘左右。HITACHI7170有4個(gè)加試劑點(diǎn)，若采用雙試劑，各5分鐘，則加R2設在第3加試劑點(diǎn)。
 

　　4反應監測時(shí)間還要考慮延遲時(shí)間的長(cháng)短、測定物質(zhì)的濃度范圍及相關(guān)臨床價(jià)值和工作效率等因素。
 

　　二、延遲時(shí)間
 

　　延遲時(shí)間(DelayTime)指試劑與樣品混合后到監測開(kāi)始之間的時(shí)間。一般用于兩點(diǎn)法和速率法，某些情況下也用于終點(diǎn)法。終點(diǎn)法應選擇反應趨于平衡的時(shí)間(穩定期或平衡期)作測定，測定點(diǎn)前即所謂的孵育期。速率法的線(xiàn)性反應期之前即延遲期。正確選擇延遲時(shí)間的長(cháng)短，有利于準確測定，減少試驗誤差。設置一般根據試劑盒的說(shuō)明書(shū)，還應考慮本室的儀器特點(diǎn)和工作程序。
 

　　1.儀器特點(diǎn)比如，半自動(dòng)生化儀多為流動(dòng)比色池，要考慮泵速、進(jìn)樣管長(cháng)短、反應液黏稠度及混合情況，以及室溫、反應液溫度同反應要求溫度間的溫差等。全自動(dòng)生化儀的測定讀數設置方式不同，直接以“秒”設置，或以測定點(diǎn)設置、測定點(diǎn)間隔時(shí)間不一樣，需要靈活掌握。
 

　　2.試劑及方法學(xué)
 

　　(1)試劑組成在酶活性的連續監測法時(shí)，若試劑含工具酶數量多、偶聯(lián)反應多，則激活反應時(shí)間一般較長(cháng)，延遲時(shí)間也較長(cháng)，如肌酸激酶(NAC法)延遲時(shí)間常設置120-180秒；若試劑中底物經(jīng)待測酶催化，其產(chǎn)物可以直接測定的，則延遲時(shí)間較短，如-谷氨酰轉移酶(GGT)設定30-60秒。同一項目同一方法，但試劑配方不同，其反應快慢等特征也可能不同，如白蛋白測定。白蛋白與溴甲酚綠(BCG)為即時(shí)反應，10秒鐘內已完成，其后球蛋白等也將與BCG發(fā)生反應，所以孵育時(shí)間不能延長(cháng)。但在同一測定時(shí)間，BcG濃度、緩沖液種類(lèi)、pH和表面活性劑不J司的試劑，測定結果可能差異明顯。
 

　　(2)樣品異常成分干擾有的試驗項目需要用工具酶將內源性代謝產(chǎn)物耗盡，比如丙氨酸氨基轉移酶活性測定試劑中須有足量的乳酸脫氫酶(LDH)。如果使用單試劑，正常血清樣品延遲時(shí)間60秒即可；但當內源性酮酸增多(如酮癥酸中毒)時(shí)，試劑內LDH常常不能在60秒內*將其清除，剩余酮酸會(huì )進(jìn)入監測期干擾測定，使測定結果偏高，所以延遲時(shí)間應增至90～120秒。采用雙試劑，則可在加入R1后即進(jìn)入預孵育期。
 

　　(3)方法學(xué)要求比如肌酐(Jaffe法)測定的特異性不強，一般認為反應前20秒左右為乙酰乙酸等快反應干擾物呈色，后約80～100秒為蛋白質(zhì)等慢反應假肌酐呈色，20~60秒肌酐呈色反應占主導地位。采用兩點(diǎn)法或速率法可減少干擾，但具體取多長(cháng)的延遲時(shí)間，應根據試劑和儀器讀數特點(diǎn)，以干擾試驗等方法來(lái)評價(jià)決定。
 

　　3.工作程序要在保證準確性的前提下，合理設置參數，提高工作效率。突出的例子是半自動(dòng)生化儀上酶活性連續監測法的延遲時(shí)間設定。由于只能單份樣品逐一測定，若延遲時(shí)問(wèn)全部設置在儀器內，每個(gè)延遲時(shí)間加監測時(shí)間至少1分鐘以上，守候時(shí)間較長(cháng)。工作量大時(shí)，可以根據儀器控溫、加樣及讀數和試劑特點(diǎn)，以及室溫情況，將延遲時(shí)問(wèn)挪一部分到機外，套式操作，但要確保機內延遲時(shí)間不要進(jìn)入線(xiàn)性反應期。
 

　　4.要兼顧延遲時(shí)間和監測時(shí)間反應時(shí)間是有限制的。在速率法和兩點(diǎn)法中，延長(cháng)延遲時(shí)間必然縮短線(xiàn)性監測期，減少測定的線(xiàn)性范圍，也易發(fā)生底物耗盡。
 

　　三、樣品量、試劑量與稀釋量
 

　　有關(guān)參數包括樣品量、試劑量、稀釋水量、小反應體積和大比色杯容量等。如HITACHI7170反應體積180~380µl，大體積570µl。BT224半自動(dòng)生化儀流動(dòng)比色池容積33µl，吸液量200～990µl，適體積500µl。
 

　　1.小反應體積在儀器光度讀數要用于結果計算時(shí)，反應液液面高度不低于光度計光徑的小體積。它保證儀器的正確讀數和計算，也是儀器測定精度和經(jīng)濟性的指針之一。在有的儀器中，它以反應體積的下限表示，有的則專(zhuān)門(mén)標明小反應體積。在單試劑測定中，樣品與試劑的總體積不得少于此參數。在雙試劑測定中，若R1與樣品的反應讀數不納入結果計算。R1自勺加液量可不考慮此參數，如連續監測法；否則應考慮它對結果的影響，如終點(diǎn)法在加R2之前讀數，并以此來(lái)扣除試劑或樣品空白時(shí)。
 

　　在半自動(dòng)生化儀中，適吸人量相當于少反應體積。它與進(jìn)液管道長(cháng)度、流動(dòng)比色池容積，吸液泵抽吸力大小和液體黏稠度有關(guān)，它要保證光度檢測不受空泡和前后樣品攜帶污染的干擾。因此，吸人體積不能任意降低，必要時(shí)，應加大反應液量和吸人量。
 

　　2.大比色杯容量這個(gè)參數含義明確。在有的儀器中，它以反應體積的上限表示，有的則專(zhuān)門(mén)標明大比色杯容量。反應液超過(guò)此體積，將致液體外溢，儀器測定系統被污損。
 

　　3.樣品試劑比例樣品與試劑的比例(SV：RV)，也可表示為樣品體積分數——樣品體積與反應液總體積的比值(SV/TV)，是方法學(xué)基本參數。酶活力測定中，樣品在總體積中的比例應在10%以下。一般來(lái)說(shuō)，待測物質(zhì)在樣品中含量低的、生理波動(dòng)范圍大的，樣品用量較大。如Trinder反應測定血清葡萄糖、膽固醇等，樣品試劑比例多為1：1OO，測定血尿酸或高密度脂蛋白膽固醇，常增加為1：50；ALT和AST的樣品試劑比例多為1：1O至1：20。方法靈敏、吸光度高的實(shí)驗方法，樣品試劑比例小,如白蛋白BCG法，樣品試劑比例常為1：200。肌酐Jaffe氏法監測時(shí)間短、吸光度值較低，樣品試劑比例多為1：10。一般應以試劑說(shuō)明為準，不宜輕易改動(dòng)。
 

　　(1)改動(dòng)樣品試劑比例，影響一系列方法學(xué)參數。若比例增大，則線(xiàn)性范圍縮小，線(xiàn)性反應時(shí)間縮短，樣品內源性干擾、基質(zhì)效應增加、旁路反應會(huì )增強，方法特異性也下降。若比例減少，檢測信號偏低，信噪比(噪音/信號)增大，當儀器精度不高時(shí)，會(huì )加大測量誤差。
 

　　(2)改動(dòng)樣品試劑比例，對某些反應有影響。如堿性磷酸酶(AI_P)，有文獻報道：當樣品試劑比例從1：25降至1：50時(shí)，酶活力測定值增加，再低于1：50時(shí)不再增加。這一效應可能是較高稀釋度下AIJP多聚體解聚的結果。體液樣品稀釋也可能對測定結果產(chǎn)生影響：④大多數蛋白質(zhì)在濃溶液中的分子構象比稀溶液中穩定，樣品稀釋可影響酶的穩定性。(2)降低樣品中內源性抑制劑或激動(dòng)劑的濃度，如以蒸餾水稀釋血清，可能因降低血清中淀粉酶的激動(dòng)劑氯離子的濃度，致測定淀粉酶結果偏低；隨血清稀釋倍數增加，肌酸激酶測定活力增加，可能與降低樣品中AMt，、胱氨酸等內源性抑制劑有關(guān)。
 

　　(3)雙試劑時(shí)要兼顧R1、R2和樣品三者的比例，尤其不宜改動(dòng)試劑間的比例。R2要考慮儀器規定的加液小體積，同一試劑瓶死體積下分液量小而浪費大的經(jīng)濟問(wèn)題等。
 

　　4.稀釋(水)量在加樣或加試劑時(shí)，加入去離子水或可以的液體。它的主要用途有兩個(gè)。一是用于濃縮試劑的稀釋?zhuān)驑悠?、校準品的稀釋。二是在樣品加量小的時(shí)候用來(lái)沖洗樣品探針，減小攜帶誤差；但用量不宜太多，以免稀釋試劑影響反應。要把稀釋水量納入樣品試劑比例和反應液總體積考慮。必要時(shí)，干粉試劑復溶也要考慮此因素。
 

　　四、試劑空白(Reagentblank)監測參數
 

　　無(wú)樣品或以水代替樣品在反應過(guò)程中觀(guān)察試劑空白值或其變化情況，主要用于監測試劑質(zhì)量及儀器穩定性，利用試劑空白對試劑本身或反應漂移引起的誤差進(jìn)行補償，用以校正△A或△A/min。它與測定波長(cháng)、光徑大小、不同試劑及配方和樣品試劑比例等有關(guān)，不能盲目套用，必要時(shí)宜實(shí)際測定。
 

　　1.試劑吸光度上限和下限定點(diǎn)監測試劑的吸光度。它常用規定波長(cháng)及光徑下的吸光度值表示。儀器的試劑空白檢測點(diǎn)因儀器和測定方法的不同而有差異。終點(diǎn)法常在PO點(diǎn)讀數，連續監測法常以反應監測起始點(diǎn)來(lái)判讀。儀器在試劑空白檢測及相關(guān)的校準測定時(shí)，若監測到超過(guò)此參數的限值，則提示試劑失效或校準無(wú)效。反應吸光度向上的試驗取上限值：如Trinder反應以酚或2-羥-3，5-二氯苯磺酸等和4-氨基安替比林作用，生成紅色素，試劑有一定的自發(fā)氧化，其試劑一般要求試劑吸光度上限≤0.1-0.4。以結合型硝基苯衍生物作為底物的ALP和GGT常要求≤0.6~0.8。反應吸光度向下的試驗取下限值：如以NADH或NADPH為輔酶的ALT和Urea(紫外法)等試驗，一般要求試劑吸光度下限≥1.0。
 

　　2.試劑空白速率顧名思義，它是在反應過(guò)程中對試劑空白的變化速率作連續監測，其數值在樣品測定結果中自動(dòng)扣除。試劑中可能混有的其他雜酶或干擾物對試劑空白速率有影響。在酶促反應中，試劑空白速率也是試劑在監測過(guò)程中底物自發(fā)降解的結果。底物為還原型輔酶者，本身不穩定而分解，多呈下降趨勢；以硝基苯酚或苯胺的衍生物作底物，在堿性環(huán)境中自發(fā)水解成被測物質(zhì)，多呈上升趨勢。此參數主要用于連續監測法。一般認為酶活性測定的試劑空白速率(△A/min)應≤0.001~0.003。由于試劑空白速率與儀器檢測下限、正常參考范圍下限等指標有關(guān)，有時(shí)也以濃度單位表示。要根據K值、儀器穩定性、方法允許變異而定。例如，ALT或AST40U/L以下活力濃度的分析誤差應≤10%，其試劑空白速率應≤4.0U/L。一些儀器的程序參數中沒(méi)有此參數，但我們應在試劑空白的測定資料中關(guān)注它，若資料波動(dòng)大，須查找試劑或儀器原因。
 

　　3.試劑空白的日常監測測定方法設置了試劑空白的項目，都要先行作試劑空白測定，在樣品測定計算中自動(dòng)扣除。由于試劑空白不是在每一個(gè)樣品測定中實(shí)時(shí)測定并扣除，當樣品測定中試劑的變化在未達到參數設置限值時(shí)不易發(fā)現，試劑空白扣除會(huì )產(chǎn)生誤差。所以，應根據試劑的穩定性確定試劑空白及相關(guān)的校準的測定頻率。連續監測法的試劑應每天(尤其在換另瓶或另批號試劑時(shí))常規測定此參數。對樣品的異常結果.也應及時(shí)對其測定吸光度資料(包括與試劑空白有關(guān)的資料，例如PO點(diǎn)讀數)觀(guān)察分析。
 

　　4.有的半自動(dòng)生化儀沒(méi)有試劑吸光度上限和下限設定，但一般在測定屏幕都顯示初始吸光度值，應人工加以判斷。酶活力測定結果呈負值，有時(shí)可能與試劑空白錯誤有關(guān)。
 

　　5.試劑吸光度上限和下限不是試劑質(zhì)量的指針。因此，一定的校準頻率和室內質(zhì)控是質(zhì)量保證的必需手段。我們在實(shí)際工作中就遇到酶活力測定的試劑空白數據在規定限值內，但質(zhì)控物測定結果連續偏低，病人結果因每天標本少而難以判斷，后發(fā)現是試劑質(zhì)量下降。
 

　　五、波長(cháng)的選擇及測定模式
 

　　波長(cháng)(Wave1ength)的正確選擇有利于提高測定的靈敏度和減少測定誤差。光度學(xué)方法有單波長(cháng)和雙波長(cháng)之分，有的儀器可用三波長(cháng)、甚至多波長(cháng)，以及兩波長(cháng)比率等。有的儀器可作導數光譜分析。單波長(cháng)測定易受樣品溶血、黃疸、脂濁等因素干擾。雙波長(cháng)測定可以通過(guò)副波長(cháng)加以修正，減少甚至消除干擾因素，提高測定準確性。采用同光束雙波長(cháng)，亦有利于排除光源強度變化對結果的影響。
 

　　1.測定波長(cháng)選擇有三個(gè)主要條件：
 

　　(1)待測物質(zhì)在該波長(cháng)下的光吸收大。
 

　　(2)其吸收峰宜較寬而鈍，而不是處于尖峰或陡肩，一般不選光譜中的末端吸收峰，換句話(huà)說(shuō)，該吸收峰處的吸光度隨波長(cháng)變化較小。
 

　　(3)常見(jiàn)干擾物在該波長(cháng)下的光吸收小。試劑盒說(shuō)明一般已提供波長(cháng)參數。實(shí)際波長(cháng)選擇需要了解待測物質(zhì)和干擾組分對不同波長(cháng)單色光的吸收程度，即以波長(cháng)為橫坐標、吸光度為縱坐標作吸收光譜曲線(xiàn)(光吸收曲線(xiàn))。
 

　　采用透射免疫比濁法，免疫復合物大小約35~100mn之間，于波長(cháng)290~410nm下有大吸收峰，常取340nm；如用膠乳增強免疫濁度法，理想的檢測波長(cháng)可增至可見(jiàn)光區。
 

　　2.雙波長(cháng)測定當待測物質(zhì)與干擾組分的吸收光譜互相重疊、出現非特異光吸收，或因反應液混濁出現光散射時(shí)，可以采用雙波長(cháng)(或多波長(cháng))測定。雙波長(cháng)測定的原則是根據干擾組分和待測物質(zhì)吸收光譜的峰形特征，選擇兩個(gè)波長(cháng)和，使干擾組分在這兩個(gè)波長(cháng)處的吸光系數相等，而使待測物質(zhì)在兩波長(cháng)處的吸光系數有顯著(zhù)差別。以?xún)刹ㄩL(cháng)分別測定分析溶液的吸光度，以?xún)蓚€(gè)吸光度值之差(△A)計算。雙波長(cháng)選擇常見(jiàn)：血紅蛋白340nm和380nm波長(cháng)吸光度相同，以NADH或NADPH作為測定底物或產(chǎn)物的試驗常采用340/380nm；有的也.采用340/405nm。ALP和GGT常使405/476nm，Trinder反應多選取520/600nm或550/660nm.免疫比濁常選用340/700nm等。
 

　　連續監測法中，要注意雙波長(cháng)測定有兩種類(lèi)型的機型：主波長(cháng)全程監測副波長(cháng)單點(diǎn)監測，和雙波長(cháng)全程監測。不僅因為后者的準確性?xún)?yōu)于前者，而且因為酶活性測定的K值計算與波長(cháng)及摩爾吸光系數有關(guān)，更顯重要。
 

　　副波長(cháng)單點(diǎn)監測：試劑和樣品混合后，雙波長(cháng)只測一點(diǎn)，此后只用主波長(cháng)連續監測；計算時(shí)，全部x主吸光度值均減去同一λ副吸光度值。K值計算代入主波長(cháng)摩爾吸光系數即可。機型如Monarch1000，TechniconRA1000等。
 

　　雙波長(cháng)全程監測：全程每～測定點(diǎn)均用雙波長(cháng)同測，并各自用λ主吸光度值減去λ副吸光度值。因為所測指示酶或產(chǎn)物在λ副波長(cháng)時(shí)也存在一定的吸光系數，K值計算代入的摩爾吸光系數值應采用ε主減去ε副。如NADH的ε為6.22×10，為1.33×10，ALP產(chǎn)物ε為18.5x×10，ε為0.2×10很??；GGT產(chǎn)物在副波長(cháng)處無(wú)吸光系數。